摘要：本文以生鲜毛蚶为研究对象，食用菌灭菌设备利用正交试验设计方法研究了不同压力、温度和保压时间对生鲜毛蚶中微生物（细菌、霉菌、酵母菌）存活率的影响，确定了生鲜毛蚶超高压杀菌工艺条件，为建立和推广海产品超高压杀菌工艺提供了实例。结果表明，当温度为20℃～40℃，保压时间为5min～15min时，压力在300MPa～500MPa范围内对生鲜毛蚶中各种微生物杀灭作用显著（P<0.01）。最终确定压力500MPa、温度40℃、保压时间5min为生鲜毛蚶超高压杀菌工艺。验证试验取得了相同的杀菌效果。
毛蚶等海产品中含有多种人体必需的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素及微量元素，对促进人类健康十分有益[1]。超高压技术(ultra-high pressure processing, UHP，100～1000MPa)是一项食品加工领域新技术。相对于传统杀菌方法，其杀菌作用均一、迅速，对食品的风味物质、色素等小分子物质的天然结构无影响，很好地保持了食品原有的风味、色泽和营养成分，还具有低能耗、对环境无污染以及少用或不用化学添加剂等诸多优点[2]。若将像生鲜海产品这样的生食先经超高压处理再经简单加热食用不但没有改变原生鲜风味，满足了人们对生鲜食品的需求，而且大大提高了食用安全性[3]，
本文利用正交试验设计方法，研究了超高压技术中压力、温度、保压时间等因子对生鲜毛蚶中各种微生物存活率的影响，确定了生鲜毛蚶超高压杀菌的工艺条件，为建立和推广海产品超高压杀菌工艺提供了新的实例。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 新鲜毛蚶购于天津市王顶堤水产批发市场。
1.1.2 微生物培养基与试剂营养琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、伊红美蓝固体培养基、乳糖发酵培养基、EC肉汤培养基、孟加拉红琼脂（六种培养基均为北京奥博星生物技术有限责任公司生产）；YPD琼脂培养基、革兰氏染色液、0.85%灭菌生理盐水，均根据中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂（GB/T 4789.28-2003）配制，所用试剂均为生物纯或分析纯。
1.2 仪器设备
超高压处理装置：HPB.A2-600/0.6超高压生物处理机（以水为加压介质，天津市华泰森淼生物工程技术有限公司）。
其他仪器设备：超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。
1.3 试验方法
1.3.1 正交试验方法设计
应用超高压技术对海产品进行杀菌时，除了加压压力外，加压温度、加压时间等也是影响杀菌效果的重要因素。将上述3个因素按L9（34）正交表安排试验，试验因素与水平见表1。
表1 因素水平表
Table 1 Factor-level design
水平 | 因素A
压力（MPa） | 因素B
温度（℃） | 因素C
保压时间（min） |
1 | 500 | 40 | 5 |
2 | 400 | 30 | 10 |
3 | 300 | 20 | 15 |
1.3.2 试样的准备：将新鲜毛蚶用自来水洗净外壳，沥干，用高温消毒的聚乙烯塑料袋（长×宽×厚＝50mm×40mm×2mm）密封包装（不留顶隙，每袋装约80g新鲜毛蚶和40ml无菌水），于10℃冷藏备用（等待超高压处理或等待检测微生物含量）。
1.3.3 超高压处理
试样加热：未加热前传压介质温度为室温；实验前，高压容器外夹套加热容器中传压介质至要求温度并用循环热水浴保持此温度。
高压处理：袋装试样浸泡于高压容器的传压介质——水中，按照实验设计，设定压力、温度和加压时间等参数，进行超高压处理。
1.3.4 微生物存活率测定方法
根据中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验方法部分（GB/T 4789-2003）和中华人民共和国卫生部1991年5月16日颁布的《药品卫生检验方法》检验经超高压处理和未处理（对照样）毛蚶袋装样品中的细菌总数（单位：CFU/g）、霉菌（单位：CFU/g）和酵母菌（单位：CFU/g）数量，并于验证试验中对大肠菌群（单位：MPN/100g）和致病菌进行了检测。细菌、霉菌和酵母菌的存活率按下式计算：
存活率=（经超高压处理后样品的菌落数/未处理样品的菌落数）×100%
2 结果
2.1 结果分析
正交试验结果见表2。由表2可知，以细菌存活率为考察指标时，因素A对细菌存活率影响较大，B、C次之，且A3〉A2〉A1，B3〉B2〉B1，C1〉C2〉C3，直观分析结果表明最佳工艺组合为A1 B1 C3；以霉菌存活率为考察指标时，因素A对霉菌存活率影响较大，B、C次之，且A3〉A2〉A1，B3〉B2〉B1，C3〉C2〉C1，直观分析结果表明最佳工艺组合为A1 B1 C1；以酵母菌存活率为考察指标时，因素A对细菌存活率影响较大，B、C次之，且A3〉A2〉A1，B3〉B1〉B2，C1〉C2〉C3，直观分析结果表明最佳工艺组合为A1 B2 C3。
进一步作方差分析并进行F检验，得到因素显著性分析结果，见表3。在试验选取的参数范围内，由于保压时间对生鲜毛蚶中各种微生物存活率均无显著影响，因此综合考虑以上分析结果及经济因素，确定最佳工艺组合为A1B1C1，即将每袋装约80g新鲜毛蚶和40ml无菌水的样品放入事先预热至40℃的超高压生物处理机内，加压至500MPa，保压5min。
表2 [L9（34）]正交试验方案及试验结果
Table 2 The [L9（34）] orthogonal design and experiment results
编号 | 因素A | 因素B | 因素C | 微生物存活率（%） |
细菌 | 霉菌 | 酵母菌 |
1 | 1 | 1 | 1 | 0.27 | 18.77 | 22.80 |
2 | 1 | 2 | 2 | 0.42 | 19.85 | 21.89 |
3 | 1 | 3 | 3 | 0.53 | 25.36 | 25.21 |
4 | 2 | 1 | 2 | 1.56 | 36.79 | 36.79 |
5 | 2 | 2 | 3 | 2.19 | 40.16 | 32.56 |
6 | 2 | 3 | 1 | 3.56 | 38.95 | 38.98 |
7 | 3 | 1 | 3 | 5.56 | 58.45 | 46.21 |
8 | 3 | 2 | 1 | 8.13 | 56.66 | 48.37 |
9 | 3 | 3 | 2 | 8.87 | 62.54 | 47.87 |
细菌 | K1 | 1.22 | 7.39 | 11.96 | G=31.09
CT=107.40 |
K2 | 7.31 | 10.74 | 10.85 |
K3 | 22.56 | 12.96 | 8.28 |
R | 7.11 | 1.86 | 1.23 |
霉菌 | K1 | 63.98 | 114.01 | 114.38 | G=357.53
CT=14203.08 |
K2 | 115.90 | 116.67 | 119.18 |
K3 | 177.65 | 126.85 | 123.97 |
R | 37.89 | 4.28 | 3.20 |
酵母菌 | K1 | 69.90 | 105.80 | 110.15 | G=320.68
CT=11426.18 |
K2 | 108.33 | 102.82 | 106.55 |
K3 | 142.45 | 112.06 | 103.98 |
R | 24.18 | 5.01 | 8.14 |
表3 试验结果方差分析表
Table 3 Variance analysis of the results
变异来源 | 离差 | 自由度 | 均方离差 | F |
Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ |
A | 80.56 | 2158.85 | 878.28 | 2 | 40.28 | 1079.42 | 439.14 | 149.19** | 710.14** | 103.08** |
B | 5.24 | 30.62 | 14.83 | 2 | 2.62 | 15.31 | 7.41 | 9.70* | 10.07* | 1.74 |
C | 2.38 | 15.33 | 6.40 | 2 | 1.19 | 7.66 | 3.20 | 4.41 | 5.04 | 0.75 |
误差 | 0.54 | 3.03 | 8.52 | 2 | 0.27 | 1.52 | 4.26 |
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总和 | 88.72 | 2207.83 | 908.03 | 8 |
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注：1）Ⅰ：细菌；Ⅱ：霉菌；Ⅲ：酵母菌；2）F0.10（2，2）=9.00，F0.025（2，2）=39.00，F0.01（2，2）=99.00；3）*：差异显著；**：差异极显著。
2.2 验证试验
按上述优选出的最佳工艺进行三次试验，结果见表4，其中致病菌均未检出。验证试验结果与正交试验结果一致，证明此工艺较合理。
表4 工艺优选验证试验结果
Table 4 The results of validatory test
样品批号 | 细菌（CFU/g） | 大肠杆菌（MPN/100g） | 霉菌（CFU/g） | 酵母菌Yeast（CFU/g） |
1 | 未加压 | 52600 | 3900 | 79 | 41 |
加压 | 100 | <30 | 10 | 12 |
存活率（%） | 0.19 |
| 12.66 | 29.27 |
2 | 未加压 | 51100 | 4400 | 85 | 36 |
加压 | 92 | <30 | 10 | 8 |
存活率（%） | 0.18 |
| 11.76 | 22.22 |
3 | 未加压 | 63800 | 5300 | 97 | 50 |
加压 | 166 | 60 | 13 | 12 |
存活率（%） | 0.26 |
| 13.40 | 24.00 |
存活率平均值（%） | 0.21 |
| 12.61 | 25.16 |
3 讨论
采用正交试验设计方法辅以计算机处理，以微生物存活率为指标，最终确定压力500MPa、温度40℃、保压时间5min为生鲜毛蚶超高压杀菌工艺，为生鲜食品的开发提供了又一参考依据和新的实例。国内外也有研究人员将超高压技术应用于生鲜食品领域。如，孙秀琴等[4～8]研究了超高压技术对鲜肉、鱼中寄生虫和微生物的杀灭效应，发现经该方法处理的食品不仅可彻底杀灭鲜肉、鱼中的寄生虫和微生物，还保持了其生鲜风味和营养成分；Torsten Paarup等[9]研究发现鱿鱼在常温下经150MPa～400MPa处理15min后，随保藏期（4℃）延长处理压力越高鱿鱼感官和化学成分变化越小，微生物繁殖率越低。而且，目前，国外已经有一些超高压海鲜食品上市，例如超高压生鲜鱿鱼和已脱壳并经超高压灭菌的生鲜牡蛎等[10]。由于毛蚶中微生物的种类受到多种因素影响，如打捞地点、季节等，因此下一步研究将着眼于对上述因素的考察，以及对经超高压处理后毛蚶在贮藏过程中感官、营养物质及微生物繁殖率变化的研究。
参考文献：
［1］吴新民，孙桂清，张福崇，等．海产品的营养与药用功能[J]．河北渔业，2004，（5）：18～19．
［2］曾庆梅，潘见，谢慧明，等．中温协同超高压处理对梨汁中微生物的影响[J].食品科学，2004，25（8）：30～34．
［3］陈复生．食品超高压加工技术[M]. 北京：化学工业出版社，2005．27～28．
［4］王家玮，张雨欣，吴凤兰，等．超高压对肉类微生物的杀灭研究[J].肉品卫生，1997，（04）：3～4．
［5］孙秀琴,王家玮,刘爱芹，等．超高压对生鲜肉类寄生虫杀灭效应的研究[J].中国寄生虫病防治杂志，2000, 13（1）：75～76．
［6］刘爱芹，孙秀琴，舒晶，等．超高压对旋毛虫肌幼虫杀灭作用研究[J]. 哈尔滨医科大学学报，1997，31（5）：363～365．
［7］李懿宏，舒晶，刘爱芹，等．超高压对猪囊尾蚴的杀灭作用[J].哈尔滨医科大学学报，1997，31（6）：492．
［8］王家玮，李占胜，苏菊，等．超高压对生鲜肉类营养和新鲜度作用的观察[J].肉品卫生，1997，（8）：6～7．
［9］Torsten Paarup, Juan Antonio Sanchez, Carmen Pela′ez, et al．Chemical and bacteriological changes in vacuum-packed pressurised squid mantle (Todaropsis eblanae) stored at 4℃[J]．International Journal of Food Microbiology, 2002(74):1～12．
［10］Institute of Food Technologists．Kinetics of Microbial Inactivation for Alternative Food Processing Technologies- High Pressure Processing[R]．U. S. Food and Drug Administration Center for Food Safety and Applied Nutrition, 2000, 6, 2．
